في المقابل ، يمكن تفضيل سجلات C57BL/6 الممتازة لأنها الأكثر شيوعًا مرشحات المختبرات الفطرية وأكثر من أنظمة هيكل CRISPR تخدع مع C57BL/Six كجين موارد.يمكن العثور على إرشادات الخلافة الجينية للغاية لبناء الحمض النووي المانح نتيجة لاتحاد تسلسل جينوم الماوس الجديد (MGSC). تحتاج منطقة كل تثبيت مركّز إلى أن ينتهي الأمر بدقة من أجل عدم تقييد عناصر تنظيم واحدة.
على سبيل المثال ، لإنشاء أليل خروج المغلوب الشرطي ممتاز ، فإن فردًا كثيرًا من الوقت ، سيحصل الحمض النووي المانح للمتبرع الذي يحتوي على exon/s floxed بشكل أكثر كفاءة من مجرد الاستمتاع باستخدام SGRNAs لمساعدتك في إدخال مواقع LOXP في وقت واحد. ومع ذلك ، أي ما يعادل المعايير الحقيقية من Zygote الماوس ، سيتم التحقق من صحة SGRNAs الخاصة بك داخل مجتمع الأنسجة في حال لم يتم تقديم الفئران المانحة لتقييم الكيسة الأزياء الماوس (RAN et al. ، 2013a). يمكن استخدام الأنسجة الباريس ، مثل (Wang et al. ، 2013 ؛ Yang et al. ، 2013) لتحديد أداء تحرير الجينوم قبل الحقن ، على سبيل المثال لأن أنسجة Parece لديها أفضل كفاءة HDR من الأنسجة الجسدية (Yu et al. ، 2015).
اعتبارات التاريخ
بالإضافة إلى كفاءة SGRNA ، فإن هناك قلقًا مختلفًا بشأن تعديل الجينوم من إمكانات طفرات الخروج من الإدمان ، خاصة إذا كنت تسعى إلى التعرف على النمط الظاهري للماوس الجيد. يوفر تطبيق تصميم Cripsr Sgrna بشكل كبير قائمة بمواقع الويب الممكنة من الإضافات ، وبالتالي ، إن أمكن ، قد يتم القيام بوسائل تأسيس PCR لوضع أي طفرات غير محدودة في مواقع الويب هذه باستخدام مقايسة عدم التطابق الكيميائي. إن التكاثر لمساعدتك على نوع من الفأر “نظيف” من النوع البري من النوع البري لفصل الطفرات غير المرغوب فيها (ويفضل أن لا يقل عن اثنين من الصلبان سيتم فعله لتقليل الطفرات الهدف) (Raveux et al. ، 2017).
الخطوة الثانية تثبيت وبناء الركيزة الخطية بواسطة PCR
تعديل بروتوكولاتنا على التثبيت الفائق ، وقد يكون من المتوقع أن تكون مجموعة Zygote ، على الرغم من أنها لا ، أثناء استخدام السلالات الأخرى (Qin et al. ، 2016). يمكن أن تؤدي ولادة SGRNA ويمكنك إجراء cas9 mRNA إلى Zygote الماوس ربما بسبب اللقطة السيتوبلازمية ، وغالبًا ما تستخدم micromanipulator المتمحورة حولها ، أو عن طريق الحقن النوكلي ، عادةً مع microinjector جيد (Yang et al. ، 2014). بشكل عام ، لم يُعتقد أن أي اختلافات نمطية لها نوع من البداية (Horii et al. ، 2014).
لامتلاك تحرير الجينوم داخل عضلة الثدييات ، من المحتمل أن تصل إلى هذه الجينات جينًا جيدًا بفضل طفرة حركة الإطار.ومع ذلك ، في حالة العثور على الحمض النووي المانح ، سيتم علاج أحدث DSB الذي يحتوي على HDR ، سواء كان ذلك في الانتظام المنخفض من NHEJ أم لا. CRISPR-CAS9 حاول لاحقًا ضبطًا للسيطرة الوراثية في الحيوانات بأكملها ، بما في ذلك توليد الفئران المغلفة والضربة القاضية.
يمكن أيضًا استخدام إعادة التجميع لامتلاك عمليات الحذف ، والطفرات جزء ، والازدواج ، والانعكاسات ، والانصهار ، ويمكنك العلامات. يتم إنتاج ركيزة DNA خطي تحتوي على التحويل المطلوب على خلاف ذلك التماثلات على العنوان الحمض النووي على الأنسجة. GAM أفضل مكافآت الكازينو عبر الإنترنت ليست مطلوبة بالتأكيد لإعادة التجميع ولكنها تزيد من انتظام إعادة التركيب DSDNA بقدر 20-bend.EXO عبارة عن DNA DNA مزدوج 3 بوصات ، والتي يمكن أن تحتاج إلى إعادة تركيب DSDNA. إن بروتينات بيتا الطازجة ، وهي بروتين صحي SSDNA الرائع ، هو إعادة التسلط الرئيسي في إعادة التجميع. والجدير بالذكر أن خصائص إعادة التركيب المضيفة ، مثل إعادة تركيب البروتينات اللازمة للبروتين الضروري ، لا تحتاج إلى إعادة تجميع.
فيما يتعلق بالخطة خارج موقع LOXP ، تنتج إعادة التركيب الجديد حذفًا أو انقلابات لجينات عائلة العنوان الخاصة بك. نظرًا للطبيعة المحفزة من CRE-LOXP ، من المحتمل أن يتم إحداث خروج المغلوب الطازج من المواد الكيميائية مثل Tetracyclin وسوف تاموكسيفان. تعمل Tetracyclin داخل النسخ الجديد لنسخ CRE Recombinase بينما تاموكسيفان تمثل النقل النووي. إن الاشعال المرافعة دائمًا لإنشاء منتج يكون فيه Indel غير متماثل في معدات PCR الجديدة. سيتم بعد ذلك انقضاء أي عدم تطابق بواسطة T7E1 Chemical (WT – WildType ؛ HT – غير متجانسة) للمساعدة في جعل بعض الأجزاء المخفضة لحل الاغاروز المتحمس.
في حين أن فريق أوليفاريس ينقل منطقة صدره للذهاب إلى ما بين العلامة التجارية الجديدة إلى الجانب الأيمن من Castillo ، فإن Castillo الصحيح المفرط سيكون بمثابة إطار للاستقالة من أوليفاريس بعيدًا عن الحصول على المطبخ. إلى مكانتك الجسدية في مكانها ، يضع Castillo العلوي لإفساح المجال للتأكد من أنه قادر على الخروج من الطفقين ، وإعادة ضبطه من أجل مسافة مواتية. على الرغم من أنه لا ، كلما لم يكن أوليفاريس قادرًا على الذهاب إلى الطفقة على الجانب المفضل لديهم ، فإن قدرتهم على الخداع مع خطافه المتبقي قد انخفضت بشكل خطير.
بالإضافة إلى أعلى الحذف ، توفر الإدراج الجيني العالي في وقت واحد أنه يمكنك الاستمتاع بـ CRISPR (Zhang et al. ، 2015). كانت الحقن بعيدة عن SgrNAs المزدوجة مثالية أيضًا لأن الطريق للمساعدة في احتمال تركز الجينات الأحدث ، خاصة إذا تم تمنيات تعديل الجينات ثنائية الأليال (Zhou et al. ، 2014). تم الكشف عن طفرات خارج الهدف في المقام الأول لتحرير جينوم كريسبر داخل أنسجة سرطان الإنسان ولكن يمكن أن تصبح نادرة في زيجوت الماوس الجيد (Fu et al. ، 2013 ؛ Yang et al. ، 2013).ومع ذلك ، لا تزال الطفرات خارج الهدف مشكلة عند النظر إلى الفئران المهندسة وراثيا. يؤدي CAS9N الفردي المقطوع إلى مجرد صدع سلسلة واحدة يتم إصلاحه بسهولة ؛ لذلك ، لصنع DSB الفعلي ، من المتوقع اثنين من sgrnas. توفر CRISPR-CAS9 Tech في الغالب استهداف الجينات المتغيرة في أنسجة الباريس لأن طريقة تحرير الجينوم داخل الفئران ، بما في ذلك بسبب التصميم البسيط واليوم الأقصر اللازم لاشتقاق الفئران المخترع.
- نظرًا لأن دوران الحضرية يركز على الجانب الرائد من بالومينو ، فإن بالومينو غير قادر على رمي الاتصال اليمين بالقيادة.
- محاولة Ecori المتحمسة تجرب تدميرها على إدخال الحمض النووي المانح الخاص بك من أجل دعم التنميط الوراثي لماوس Knockin Mouse الذي تم إنشاؤه من كريسبر حيث لا يتم قطع فرقة Ki PCR بواسطة LSO.
- قد تحتاج أعلى الإدراج أو عمليات الحذف ، ولكن لا ، إلى عدد قليل من sgRNAs لمدة مدة الحمض النووي الجيني تمامًا كما تم استبدالها في بعض الأحيان.
- يفضل تصميمات الماوس الشرطي لفحص الحالة الفردية حيث يظهر كلاهما تشابه في النمط الظاهري عندما تتم إزالة جينات عائلية معينة.
- تم إدراج إدراج من واحد إلى 2 كيلو بايت فقط مع CRISPR ، ومع ذلك ، فإن النتائج بعيدة عن HDR تقلل عمومًا حيث يزداد حجم حجم الإدخال الجديد بعد حجم تكنولوجيا المعلومات.
خارج سعة النوى الدنا ل Cas9 ، تم إعادة استخدام CRISPR أيضًا لدمج وضع LED الحمض النووي الريبي المتحمس لتنظيم نشاط النسخ الجديد من علم الوراثة المركزة. يتم تحقيق ذلك حقًا من خلال الاستمتاع بمساحة Cas9 (DCAS9) التي تم تنشيطها بشكل كبير والتي يتم دمجها على المنشطات النسخي ، والمثبطات ، ويمكنك أن تتمكن من المعدلات اللاجينية (Komor et al. 2017). بدلاً من ذلك ، يمكن أيضًا تحقيق تنشيط الجينات الجيني الذي يحتوي على نوع المكسرات Cas9 باستخدام SgrNAs المعدلة التي تم تصميمها مع Aptamers MS2. يتم تقصير مثل هذا SGRNAs غير النشطة في الواقع لإيقاف إنشاء DSB ، بينما تقوم Aptamers MS2 بتسجيل مزيج من البروتين الضروري الذي يتكون من البروتينات البكتيرية الجديدة MS2 الجديدة المرتبطة بمنشط النسخ الممتاز (Liao et al 2017). ما هي استراتيجية تنشيط الجينات التي تستهدف داخل الفئران لدفع التعبير الموجه من علم الوراثة المعترف بها للمساعدة في تحسين المرض مثل جميع أشكال مرض السكري ، ومشكلة الكلى ، وسوف تضم ضمور العضلات.
هذا النوع من تقنيات استهداف الجينات ، وكذلك النمو النهائي لتكنولوجيا CRISPR-CAS9 ، وقت أصغر بما يكفي لتطوير الفئران المهندسة بشكل طبيعي من 8 أشهر من أجل من 3 أشهر. CRISPR-CAS9 التقنية ، على الرغم من أنها ليست ، ميزات ZFNs المحلولة بشكل أساسي ويمكنك التالين من حيث سهولة البناء وقد تصمم (الشكل 1). يجب أن يكون لدى ZFNS و Talens التجميع بعيدًا عن مجالات ربط الحمض النووي المتعددة لكل عنوان جيني جديد. يعتمد CRISPR على تكوين مجمع بروتينات ريبونوكليوبروتين بين Cas9 من الحمض النووي الخاص بك ويمكنك RNA “دليل” ممتاز لإرساله حيث يحدث DSB الجينومي مع الاستمتاع بنسبة 20 في المليون من تنسيق الخلافة التكميلية.
朝倉ドローンプロジェクト
朝倉商工会議所青年部（朝倉YEG）
最近のコメント